Ваниль

Оду очистил и охарактеризовал β-глюкозидазу ванили. Был выделен фермент с нативной молекулярной массой 200 кДа, оптимальным pH 6,5, оптимальной температурой 40°C, K_m 1,1 мМ с pNPG и 20 мМ с глюкованилином и V_m около 5 мккатал/мг с двумя субстратами (Odoux et al., 2003).

Ханум получил значение K_m 0,38 мМ с pNPG, а Дигнум – значение K_m, равное 3,3 мМ из сырого ферментного экстракта зеленых стручков (Hanum, 1997; Dignum et al., 2004). Последний также изучал кинетические параметры сырого ферментного экстракта с различными глюкозидами.

Полученные данные показывают, что фермент имеет большее сродство к глюкозидам ванилина, феруловой кислоты и пара-гидроксибензальдегида, чем к глюкозидам ванильной кислоты, гваякола и креозола, и не проявляет активности к глюкозидам пара-крезола и 2-фенилэтанола.

Предыдущее исследование (Dignum et al., 2002), основанное на мониторинге ароматических соединений во время вяления в лабораторных условиях для партии ванили из Индонезии, тем не менее, показало снижение глюкозида гваякола (по крайней мере, глюкозида, идентифицированного как такой), которое оказалось менее очевидным для глюкозида ваниловой кислоты. Результаты, полученные для других соединений (только формы агликона), привели этих авторов к выводу, что образование второстепенных соединений, таких как пара-крезол и 2-фенилэтанол, кажется происходит посредством химического процесса, а не ферментативного, что отсутствие ферментативной активности в отношении глюкозидов этих двух соединений, по-видимому, подтверждает.

В ходе исследования ароматических соединений, во время обработки ванили традиционным способом в Мексике, обнаруженочто из 17 идентифицированных глюкозидов 11 гидролизуются лишь незначительно, если вообще гидролизуются (Perez-Silva 2006), , что, по-видимому, подтверждает предыдущие выводы (Dignum et al., 2002). Эти 11 соединений представляют собой глюкозиды креозола, 4-винилгваякола, метилсалицилата, пара-гидроксибензойной кислоты, пара-крезола, анизилового спирта, 2-фенилэтанола, фенилпропанола, бензилового спирта и коричного спирта (рис. 12.5).

Подводя итог, можно сказать, что действие β-глюкозидазы на определенное количество глюкозидов-предшественников аромата четко установлено в развитии ванильного аромата во время вяления, но гораздо менее очевидно для некоторых других, даже если могут присутствовать их соответствующие агликоны (см. ниже).

Тем не менее следует подчеркнуть, что с учетом очень низких концентраций этих соединений, естественной изменчивости и их реакционной способности (особенно свободных агликонов) и т. д., мониторинг во время вяления очень трудно осуществим и требует особого внимания к размеру образца, чтобы избежать иногда наблюдаемых беспорядочных смещений и колебаний. Это подразумевает конкретные исследования, которые часто отсутствуют.

Подходы, которые заключаются в изучении кинетических параметров различных глюкозидов-предшественников аромата на очищенной β-глюкозидазе(ах), несомненно, более наглядны для установления раз и навсегда, являются ли эти глюкозиды субстратами фермента, но явно подразумевают получение глюкозидов и очищенного фермента, что само по себе представляет собой большой объем работы.

Также можно работать с сырыми экстрактами ферментов, а не с очищенными ферментами, чтобы упростить задачу и убедиться, что все активности β-глюкозидазы (если их несколько) присутствуют в зеленых стручках. Тем не менее следует помнить, что фермент(ы) могут контактировать с продуктами, которые влияют на кинетические параметры (активаторы/ингибиторы), которые в противном случае не вступили бы в контакт с зеленой ванилью или во время вяления.

Исходя из опыта, мы наблюдали во время разработки нашего ферментативного теста, что экстракция фермента с низким соотношением буфер/стручки (например, 4:1 об/мас) приводила к быстрой и значительной потере активности β-глюкозидазы (даже при использовании защитного агента, такого как антипротеаза, антиоксиданты и т. д.), в то время как очень высокое соотношение буфер/стручки (2000:1 об/мас) позволило достичь высокой стабильности в течение более 4 часов хранения при температуре окружающей среды без какого-либо защитного агента в буфере для экстракции (неопубликованные результаты). Эти наблюдения предполагают присутствие соединений, которые ингибируют активность β-глюкозидазы, в умеренно разбавленных экстрактах зеленой ванили.

Другие соединения

В большинстве случаев механизмы реакции, которые приводят к появлению и/или исчезновению других ароматических соединений во время вяления, еще предстоит определить.

Например, альдегиды не обнаруживаются в зеленых стручках ванили (Perez-Silva, 2006), но появляются на поздних стадиях обработки, когда их содержание достигает пика, а затем исчезают, оставаясь лишь следами, обнаруженными в ванили. Некоторые из этих альдегидов могут быть продуктами автоокисления олеиновой кислоты и линолевой кислоты (в больших количествах содержащихся в зеленой ванили).