Жизнь замечательных устройств

В принципе, в идеале для некристаллических образцов, состоящих из одинаковых частиц, требовалось не так уж много информации, описывающей их положение в условной плоскости и ориентацию в трёхмерном пространстве — для решения математической задачи, определяющей эти вопросы, требуется определить всего пять параметров. Однако реальные биологические системы отличаются от идеализированной математической модели тем, что образующие их частицы редко бывают однородными по строению, да и содержат примеси. Это приводило к необходимости создания уточнённых математических моделей, тех, которые учитывают неоднородность изучаемой системы и создания алгоритмов, позволяющих сортировать результаты исследования объекта, учитывая то, какие сигналы использовать далее для построения усреднённой картины, а от каких избавляться. В 1981 году Франк с коллегами описал метод, позволяющий сортировать образы частиц на основании их ориентации и особенностей строения (Ultramicroscopy, 1981, 6, 187–194; 10.1016/0304-3991(81)90059-0). В последующих работах Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить зёрна полезной информации, полученной в ходе электронной микроскопии, от неизбежных плевел. В 1981 году он обобщил математические модели в компьютерной программе SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields — Система для Обработки Данных Электронной микроскопии и Связанных областей, первая публикация: Ultramicroscopy, 1981, 6, 343–357; DOI: 10.1016/S0304-3991(81)80236-7). Этот программный пакет для обработки изображений, полученных с помощью электронной микроскопии, существует и обновляется до сих пор (https://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html), более того — эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу учёных во всём мире.

Как уже говорилось выше, ожидалось, что быстрое охлаждение избавит электронную микроскопию от целого ряда ограничений и позволит применять её к биомолекулам. Предполагалось, что проблемы, связанные с образованием кристалликов льда, удастся преодолеть с помощью быстрой заморозки, благодаря которой вода будет превращаться не в кристаллическую, а стеклообразную твердую фазу. Однако до 1980-х годов сама принципиальная возможность получения твердой стеклообразной воды была дискуссионной — предполагалось, что скорость охлаждения, необходимая для превращения воды в «правильное» агрегатное состояние, никогда не будет достигнута.

В 1980 году дискуссии на тему стеклообразного состояния воды были закрыты — исследователям удалось заморозить микрометровые капли воды, переведя её в стеклообразное состояние (Nature 288, 1980, 569–571; DOI: 10.1038/288569a0). Годом позже Жак Дюбоше и Алесдер МакДауэлл продемонстрировали метод, позволяющий получить тонкую плёнку твердой некристаллической воды для заморозки образцов и их последующего изучения с помощью электронной микроскопии (J. Microsc., 1981, 124, 3–4; DOI: 10.1111/j.1365–2818.1981.tb02483.x).

Предложенный метод заключался в следующем: воду распыляли на углеродную плёнку, поверх которой была размещена сетка, которую быстро погружали в жидкий этан или пропан с температурой около -190 °C, которая поддерживалась за счет охлаждения жидким азотом. Как было показано, тонкий слой стеклообразной твёрдой воды демонстрировал однородное поглощение электронов в процессе изучения криоэлектронной микроскопии. От аморфного состояния воды к кристаллическому можно было перейти, нагревая образец до -140 °C. В последующие годы Дюбоше усовершенствовал метод заморозки и приготовления образца для электронной микроскопии, а также описал результаты подробных исследований чистой воды, водных растворов и суспензий бактериофагов и молекул ДНК при криогенных температурах (J. Microsc., 1982, 128, 219–237; DOI: 10.1111/j.1365–2818.1982.tb04625.x).

Полностью потенциал метода Дюбоше был оценен в 1984 году, когда его группа опубликовала электронные микрографии суспензий вирусов (Nature, 1984, 308, 32–36; DOI: 10.1038/308032a0). Использованная для получения этих микрографий методика позволяла получать слои воды достаточно тонкие для быстрого превращения воды в стеклообразное состояние, но при этом достаточно толстые для того, чтобы в этом слое мог поместиться монослой биологически активных молекул или молекулярных комплексов в их естественной конформации.