После неудачных попыток опереться на саксонских князей для ликвидации последствий Торнского мира тевтоны нашли себе естественного союзника и покровителя в лице княжеской фамилии Гогенцоллернов, правившей с XV века в другом немецком разбойничьем государстве, Бранденбурге, тоже возникшем на чужой, исконно славянской земле за Эльбой. В 1511 году один «из Гогенцоллернов — Альбрехт Бранденбургский — был избран «великим магистром» Ордена и, обосновавшись в Кенигсберге, сразу же затеял войну с Польшей, надеясь на помощь из Германии. Помощь, однако, была оказана в незначительных размерах, и Альбрехт потерпел поражение. В 1525 году Альбрехт принял вероучение Лютера с тем, чтобы секуляризировать Орден, то есть превратить его в светское прусское герцогство. Так земли Ордена стали наследственным достоянием Гогенцоллернов, а тевтонские рыцари превратились в крупных светских помещиков, от которых произошли тупоголовые и алчные прусские юнкеры, носители пруссачества, сосредоточившего в себе все темные стороны германской истории: насилие, обман и непомерное чванство. От прусских юнкеров страдали не только негерманские народности, но и германские, прусское крестьянство. Закабалив уже в XVII веке крестьян, помешики-юнкеры забивали и запарывали их до смерти и заставляли работать на себя по семи дней в неделю на барщине. Гогенцоллерны были типичными юнкерами на троне, защищавшими интересы некоронованных юнкеров.
Кенигсберг — столица и местопребывание прусских герцогов — вырос и украсился новыми зданиями. В 1544 году здесь был учрежден университет, особенно прославившийся впоследствии тем, что в нем учился и преподавал знаменитый философ Кант. Основание университета в Кенигсберге было чисто политическим мероприятием: по мысли основателей, он должен был служить оплотом лютеранства в Пруссии и призван был идейно укрепить позицию герцога как протестантского государя, который, прикрываясь лютеранским вероучением, присвоил себе земли Тевтонского ордена.
Гогенноллерны упорно стремились к тому, чтобы объединить свои бранденбургские и прусские земли в одно государство и освободить последние из под опеки Польши. Первое они осуществили в 1618 году, когда бранденбургский курфюрст сделался герцогом прусским, а второе — в 1657 году, когда польский король вынужден был заручиться нейтралитетом Гогенцоллернов в швведско-польскую войну ценою отказа от своих суверенных прав в Пруссии. Характерно, что горожане Кенигсберга и рядовое дворянство Восточной Пруссии, боявшиеся засилья юнкерства и полицейской опеки Гогенцпллернов, энергично протестовали против отторжения Восточной Пруссии от Польши. В 1661 году собравшийся в Кенигсберге прусский сейм провозгласил, что Восточная Пруссия «составляет одно целое с польской короной, и связи, соединяющие их в течение столетий, не могут быть расторгнуты». Оспаривая действия польского короля, который санкционировал отделение Восточной Пруссии от Польши, деятели сейма говорили, что он не имеет права «распределять жителей Пруссии, как какие-нибудь груши или яблоки». Тогда же организовалась в Кенигсберге Лига горожан и дворянства, решивших противиться соединению Пруссии с Бранденбургом силой оружия. Польша, однако, не смогла оказать помощь Лиге, и когда в октябре 1662 года войска Гогенцоллернов подошли к стенам Кенигсберга, город вынужден был капитулировать.
Утратив свое значение столичного города, Кенигсберг все же продолжал играть первенствующую роль в хозяйственной и политической жизни Восточной Пруссии. В XVII веке неизменно продолжала расти торговля Кенигсберга, и уже в 1623 году через его вспомогательный порт Пиллау было вывезено 500 тысяч шеффелей хлеба. Политическое значение Кенигсберга выражалось, между прочим, в том, что прусские курфюрсты, ставшие с 1701 года королями, короновались не в своей столице — Берлине, — а в Кенигсберге.