Пералонсо Ниньо был одним из трех братьев, которые участвовали в самом первом плавании Колумба и в котором Пералонсо был лоцманом флагмана «Санта-Мария». Как и Хуан де Ла Коса, он в целом сохранял лояльность по отношению к Адмиралу, которого они оба признавали своим учителем в морских делах. Однако это не мешало ему, как и Ла Косе, воспользоваться открытием Колумба Жемчужного берега и вслед за Охедой направиться туда самостоятельно б поисках богатства. Получив королевское разрешение на организацию экспедиции вместе с запретом не приближаться ближе чем на 50 лиг к открытому Колумбом берегу, Пералонсо, подобно другим авантюристам того времени, намеревался «позабыть» об этой части монаршего приказа. Для финансирования своего плавания Пералонсо Ниньо пришлось прибегнуть к партнерам в лице братьев Луиса и Кристобаля Герра, Их общими усилиями удалось подготовить одну каравеллу с экипажем около 30 человек, которая вышла из Палоса в июне 1499 года почти по следам первой экспедиции Охеды и Ла Косы.
Ее маршрут повторял проторенный Колумбом курс через Канарские острова к северо-восточной оконечности южноамериканского материка в район залива Пасть Дракона, откуда она вышла на Жемчужный берег. В этих лее водах одновременно двигалась прибывшая туда несколько раньше флотилия Охеды, но к их обоюдному благу эти два соперника искателей богатств разминулись. Одинокая каравелла Ниньо и Герра обследовала Жемчужный берег гораздо более тщательно и спокойно, чем нетерпеливый и бесчинствующий отряд Охеды, что, возможно, и обеспечило ей гораздо более богатый сбор жемчуга. После трех месяцев хождений по побережью и Маргарите Ниньо и Герра проплыли дальше на запад к восточному берегу полуострова Гуахира, где благодаря установлению дружественных отношений с индейцами им удалось регулярно пополнять свои продовольственные запасы и даже обменять свои безделушки на золото. После неудачной попытки продвинуться далее в западные территории, где они столкнулись с крупным отрядом враждебно настроенных индейцев, испанцы повернули обратно на восток, пополняя при этом собранное количество жемчуга.
8 февраля 1500 года экспедиция взяла курс на возвращение домой и после очень трудных двух месяцев плавания прибыла к северному берегу Испании в Бискайском заливе.
Здесь очень обогатившиеся партнеры рассорились, когда братья Герра обвинили Ниньо и других участников авантюры в попытке провести привезенные драгоценности в обход королевской таможни. Но дело затем было урегулировано, и после первоначального ареста Ниньо был не только освобожден, но и восстановлен на государственной службе. Он оказался одним из самых удачливых авантюристов, разбогатевших на открытиях Колумба.
Успех инициированной им экспедиции в поисках жемчуга и золота оказался настолько грандиозным при минимальных затратах, что короли решили сами включиться в столь выгодное предприятие и организовали собственную официальную экспедицию во главе с Кристобалем Герра. Эта флотилия покинула Испанию уже в начале 1501 года, но после прочесывания Жемчужного берега отрядами Охеды и Пералонсо Ниньо ей там найти почти ничего не удалось. В порядке компенсации за это разочарование Герра привез в Испанию для продажи партию рабов. Узнавшая об этом Изабелла приказала их освободить и за счет руководителя экспедиции отправить на родину. Но через некоторое время этот приказ был отменен под предлогом того, что эти индейцы из района залива Дариен оказались неисправимыми язычниками, и Изабелла разрешила их продажу.