Подозрение в порче пало на родство прежних цариц, Анастасии Романовны и Марии Темрюковны. По этому случаю были розыск и казни. В числе других погиб в это время князь Михаил Темрюкович Черкасский, брат царицы Марии.
Царица Марфа Васильевна скончалась 13-го ноября 1571 года и погребена в соборном храме Вознесенского монастыря.
Не привыкнув и не любя сдерживаться ни в чём ни какими препятствиями, Иоанн в начале 1572 г. вопреки церковным правилам женился в четвёртый раз на Анне Алексеевне Колтовской. В Москву съехались для избрания нового митрополита (по смерти Кирилла) три архиепископа: Леонид новгородский, Корнилий ростовский и Антоний полоцкий, — семь епископов и множество архимандритов и игуменов. Прежде, нежели собравшиеся приступили к своему главному делу, царь пригласил их к себе, бил пред ними челом и просил у них прощения и разрешения по случаю своего четвёртого брака, на который он дерзнул по следующим причинам: женился он первым браком на Анастасии, дочери Романа Юрьевича, и жил с нею тринадцать лет с половиною; но вражиим наветом и злых людей чародейством и отравами царицу Анастасию извели. Совокупился он вторым браком, взял за себя из Черкасс Пятигорских девицу и жил с нею восемь лет, но и та вражиим коварством отравлена была. Подождав немало времени, он захотел вступить в третий брак, с одной стороны, для нужды телесной, а с другой — для детей, совершенного возраста не достигших; поэтому идти в монахи не мог, а без супружества жить соблазнительно; избрал себе невесту, Марфу, дочь Василия Собакина, но враг воздвиг ближних многих людей враждовать на царицу Марфу, и они отравили её, ещё когда она была в девицах; царь положил упование на всещедрое существо Божие и взял за себя царицу Марфу, в надежде, что она исцелеет; но была она за ним только две недели и преставилась ещё до разрешения девства. Царь много скорбел и хотел облечься в иноческий образ; но, видя христианство распленяемо и погубляемо, детей несовершеннолетних, дерзнул вступить в четвёртый брак. Царские богомольцы, архиепископы и епископы, видя такое царёво смирение и моление, много слёз испустили и на милосердие преклонились. Собравшись в соборной церкви Успения, они положили: простить и разрешить царя, ради тёплого умиления и покаяния, и положить ему заповедь не входить в церковь до Пасхи; на Пасху в церковь войти, меньшую дору и пасху вкусить, потом стоять год с припадающими; по прошествии года ходить к меньшой и к большой доре; потом год стоять с верными, и как год пройдёт, на Пасху причаститься св. тайн; со следующего же, 1573 г. разрешили царю по праздникам владычным и богородичным вкушать богородичный хлеб, святую воду и чудотворцевы меды; милостыню государь будет подавать сколько захочет. Если государь пойдёт против своих неверных недругов, за святые Божии церкви и за православную веру, то ему епитимию разрешить: архиереи и весь священный собор возьмут её тогда на себя. Прочие же, от царского синклита до простых людей, да не дерзнут на четвёртый брак; если же кто по гордости и неразумению вступит в него, тот будет проклят. Иоанн хотя и подчинился было соборной епитимии, но только на самое короткое время. Отправившись через месяц в Новгород и заехав 31 мая (соборное определение состоялось 29-го апреля) в Хутынь-монастырь, он действительно не входил в церковь, а стоял у церковных дверей, пока царевичи слушали в церкви молебствие. Но 7-го августа, получив в Новгороде известие о победе, одержанной нашими войсками над крымскими татарами, отправился в Софийский собор на молебен, а 15 августа присутствовал в том же соборе и за литургиею[81].
Прожив в четвёртом браке не более трёх лет, Иоанн развёлся с Анною Колтовскою, которая, как некогда Соломония, должна была отказаться от света и заключиться в Тихвинском Введенском монастыре, где скончалась в 1626 году с именем Дарии (в монашестве или в схиме).
Затем две наложницы Иоанна, Анна Васильчикова и вдова Василиса Мелентьева, не могут быть названы царицами: в современных памятниках они называются не царицами, а женщинами. Иоанн не венчался с ними, а брал только церковную молитву для сожития с ними. Анна Васильчикова схоронена в Суздальской девичьей обители, там же, где почивает и Соломония.
В пятый и последний раз Иоанн венчался в 1580 году с Мариею Феодоровною Нагою, дочерью незначительного дворянина Фёдора Фёдоровича Нагого. Замечательно распределение свадебных чинов на этой царской свадьбе: посажёным отцом царя был сын его Феодор, будущий московский царь, а дружками со стороны жениха — князь Василий Иванович Шуйский, со стороны невесты — Борис Фёдорович Годунов — оба будущие московские цари. Во время пребывания в Москве Антония Поссевина Иоанн исповедовался, но не причащался, вследствие того, что был женат на пятой жене.