Для проведения третьего этапа испытаний министром судостроительной промышленности была назначена специальная комиссия, которую возглавляли главные конструкторы Н.Н.Исанин и С.П. Королев (технический руководитель летных испытаний ракет). Первый выход на ракетную стрельбу назначили на пятый день после вступления лодки в строй. В обстановке глубокой секретности ночью с 14 на 15 сентября, на борт Б-67 была доставлена ракета. Вначале ракету подготовили на технической позиции вновь созданного полигона. Провели автономные испытания приборов системы управления, проверили герметичность двигательной установки, после чего ее заправили основными компонентами топлива. Убедившись в отсутствии замечаний, ракету доставили на трейлере на пирс, где с помощью обычного заводского портального крана и специальной погрузочной траверсы ее поставили на предварительно поднятый в верхнее положение стартовый стол пусковой установки носовой шахты и закрепили штатными стойками с захватами («корсетом»). Затем подключили отрывные кабельные разъемы, соединив системы «борта» (ракеты) с системами управления на подводной лодке. После этого автозаправщик дозаправил ракету пусковым топливом, и в 4 ч 30 мин стол с Р-11Ф опустили в нижнее положение. Погрузочные и заправочные работы проводились с выставлением трех зон охраны, с привлечением минимального числа подготовленных людей. За всеми операциями внимательно следил С.П. Королев.
С утра на лодку прибыли главные конструкторы Н.Н. Исанин (председатель комиссии) и С.П. Королев (заместитель председателя комиссии), а также представители промышленности, морского полигона, разработчики отдельных систем:
B.П. Арефьев, Ю.А. Батаев, А.А. Запольский, П.М. Зеленцов, П.В. Новожилов, И.В. Попков, В.Я. Соколов, И.В. Шаскольский, Ю.А. Щербаков, А.Н. Юшков. От «гостей» теснота была необыкновенной.
Первоначально выход намечался на утреннее время, но из-за штилевой погоды технический руководитель испытаний C.П. Королев отменил выход считая, что такая погода не обеспечит реальные условия. К середине дня задул приличный ветер, который поднял нужное волнение. Еще раз провели комплексные проверки, и, убедившись, что все системы функционируют нормально, командир капитан 2 ранга Ф.И. Козлов вывел лодку в море. Старшим помощником был В. К. Коробов, командиром ракетной боевой части — С.Ф. Бондин. «Первый» (позывной технического руководителя Королева) разместился на брезентовой разножке позади операторов для контроля их действий во время государственных испытаний. Уже на подходе к району испытаний лодку неожиданно догнал катер, на котором прибыл адмирал А. А Владимирский, временно исполнявший в то время обязанности заместителя главкома ВМФ по кораблестроению и вооружению.
Чтобы обеспечить точную стрельбу, на вновь созданном Северном морском ракетном полигоне недалеко от Неноксы на высоком берегу установили створные знаки, определяющие боевой курс подводной лодки при стрельбе и обеспечивающие выполнение задачи прицеливания, а на воде, в половине кабельтова по траверзу от боевого курса в точке старта, поставили буй. Для контроля за полетом на берегу были установлены телеметрические приемные станции. Наблюдение и связь осуществлялись специальным кораблем. Бортовая передающая аппаратура телеметрии и контроля орбиты была смонтирована в неотделяющейся головной части и работала на щелевую антенну.
На полигоне в точке старта зафиксировали метеообстановку: ветер 9 м/с, волнение 3 балла. Лодка застопорила ход: по плану намечалось произвести пуск ракеты из положения подводной лодки без хода. Но лодку сносило с курса и слегка раскачивало, поэтому решили не рисковать и стрелять с ходу. На скорости 10 узлов легли на боевой курс, качка прекратилась. За час до намеченного времени старта началась подготовка ракеты к пуску, проверка и согласование системы курсоуказания подводной лодки и гироскопов ракеты. За операторским пультом находился начальник стартовой команды инженер-капитан 3 ранга АА Запольский. Как вспоминал впоследствии командир лодки Ф.И. Козлов, все страшно волновались. У С.П. Королева, руководившего подготовкой ракеты к старту, пот градом катился со лба. В таком же состоянии пребывали и остальные руководители испытаний.
Первый в мире пуск баллистической ракеты с борта подводной лодки был произведен в 17 часов 32 минуты по московскому времени в Белом море 16 сентября 1955 г. Честь нажать кнопку «Пуск» с пульта в центральном посту принадлежала В.П.Финогееву. Вскоре пришло донесение с боевого поля: ракета, пролетев 250 км, приземлилась «с точностью в пределах тактико-технического задания». В заданном квадрате полигона от взрыва образовалась воронка глубиной 6 м и диаметром 14 м. По мнению члена-корреспондента АН СССР Б.Е. Чертока, от этого пуска «Королев получил большой заряд информации для размышления и принятия решений».