Отъезд брата в Москву доставил Варфоломею немало затруднений. Новопостроенная Троицкая церковь была освящена, но в ней некому было служить. При таких обстоятельствах Варфоломею надо было спешить с пострижением. По-видимому, он воспользовался услугами первого же священника, посетившего скит. Им оказался игумен Митрофан, вероятно из Хотькова монастыря. Обряд пострижения был совершен 7 октября 1345 года на память мученика Сергия. Так Варфоломей Кириллов в возрасте 23 лет превратился в инока Сергия. По свидетельству «Жития», Сергий провел в уединении два лета, «или более, или меньши». Инок был молод и крепок телом. Сила у него была в теле, как у двух человек. Одиночество оказалось для Сергия самым тяжким испытанием. Чтобы усмирить юную плоть, он предавался посту, обрекал себя на голод и жажду, «стояние без отдыха», «слезы теплые», «вздохи сердечные», «бдения всенощные», «коленопреклонения частые». Результаты изнурительных подвигов были налицо. Подвижнику стали являться «страшилища пустыни», «неизвестных бед ожидания», ночные страхи и видения. Однажды нечистая сила «в одеждах и в шапках литовьскых островерхых» напустилась на отшельника в церкви, другой раз — в тесной хижине, посреди ночи. К счастью, наваждения были недолгими и продолжались менее часа. Попытки сатанинского воинства изгнать Сергия из Радонежской пустыни окончились полной неудачей. Молодой инок победил искушение вернуться к людям. Он победил также и страх перед диким зверьем, населявшим округу. Особенно досаждали пустыннику волки, вывшие по ночам. Днем подле хижины стал появляться медведь. Сергий не забывал класть для него кусок хлеба на колоду. Под конец зверь стал приходить по три раза на день, что грозило истощением и без того скудным запасам монаха. Посещения косматого гостя прекратились лишь после того, как в пустыни появилось несколько келий и уединенной жизни пришел конец.
Сергий помнил заповедь Христа: «Где двое или трое собраны во имя мое, там и я посреди них». В числе первых подле Сергия поселились некий монах Василий Сухой, с верховьев реки Дубны, и другой монах — Якута, он же Яков. На Маковец потянулись также и земляки Сергия, среди них Анисим, происходивший из ростовского боярского рода. Каждый занял в обители положенное ему место: родовитый Анисим стал дьяконом, бродячий монах Якута — посыльным. Первопоселенцы трудились в поте лица, чтобы расчистить лес под монастырские кельи. Три-четыре кельи Сергий выстроил своими руками, чтобы удержать в обители прохожих монахов. Когда в Троице собралось двенадцать монахов, поселок был обнесен оградой и подле ворот поставлен привратник.
Поначалу в Троицкой пустыни не было собственного священника и братии приходилось нанимать попа из ближайшего прихода. Наконец Сергию удалось перезвать к себе, вероятно из ближайшего монастыря в Хотькове, игумена Митрофана, постриженником которого он был. Но Митрофан прожил год и умер. Пустынь на Маковце не могла превратиться в монастырь, пока у нее не было собственного игумена. По настоянию братии Сергий отправился на поставление в Переяславль.
На Руси в то время свирепствовала чума. Весной 1353 года великий князь Семен незадолго до смерти составил завещание «перед владыкою володимерским Олексеем, перед владыкою переяславским Офонасеем». Вслед за тем Алексей уехал в Византию за утверждением на митрополию, а Афанасий на протяжении двух лет исполнял обязанности главы церкви. По этой причине Сергий ездил не в Москву, а в Переяславль. Указание «Жития» на поездку Алексея в Константинополь позволяет точно датировать игуменство Сергия. Он получил сан в 1353–1355 годах, когда ему было немногим более тридцати лет.