Пейзаж кажется фантастическим, однако следует помнить утверждение Леонардо о том, что живопись — это наука. Как видно из рисунков, выполненных в одно время с картиной, он основывался на тщательных наблюдениях геологических явлений. Это относится и к изображению растений: можно не только отождествить их с определённым видом, но и увидеть, что Леонардо знал о свойстве растений поворачиваться к солнцу.
В середине 80-х годов XV века Леонардо написал картину «Дама с горностаем» (Краковский музей), которая, возможно, является портретом фаворитки Лодовико Сфорца - Чечилии Галлерани. Контуры фигуры женщины со зверьком очерчены изгибами линий, которые повторяются во всей композиции, и это, в сочетании с приглушёнными красками и нежным оттенком кожи, создаёт впечатление идеальной грации и красоты. Красота Дамы с горностаем разительно контрастирует с гротескными набросками уродов, в которых Леонардо исследовал крайние степени аномалий строения лица.
В Милане Леонардо начал делать записи; около 1490 года он сосредоточил внимание на двух дисциплинах: архитектуре и анатомии. Он сделал наброски нескольких вариантов проекта центрального купольного храма. Леонардо нарисовал план и перспективные виды всего сооружения. Примерно в это же время он добыл череп и сделал поперечное сечение, впервые открыв пазухи черепа. Заметки вокруг рисунков свидетельствуют о том, что его в первую очередь интересовала природа и строение мозга. Безусловно, эти рисунки предназначались для чисто исследовательских целей, однако они поражают своей красотой и сходством с набросками архитектурных проектов в том, что и на тех, и на других изображены перегородки, разделяющие части внутреннего пространства. Живя в Милане, Леонардо постоянно работал над проектом огромного конного монумента Франческо Сфорца, отца Лодовико, который должен был быть отлит из 90 т бронзы и помещён на шестиметровый пьедестал. Однако случилось так, что предназначенная для памятника бронза была использована для отливки пушек, а его глиняная модель была уничтожена в 1499 году при вторжении французов.
Размышления Леонардо о пространстве, линейной перспективе и о способах выражении разнообразных эмоций в живописи вылились в создание фрески, написанной в экспериментальной технике на дальней торцовой стене трапезной монастыря Санта-Мария делле Грацие в Милане в 1495–1497 годах. При помощи иллюзорных средств Леонардо расширил реальное пространство зала в область живописного пространства, с высоким столом, за которым сидят Христос и апостолы. Он изобразил тот момент, когда Христос сказал: «Истинно говорю вам, что один из вас предаст меня». Здесь Христос — центр композиции. Все средства использованы для того, чтобы подвести взгляд к фигуре Христа: и основные цвета одежды (красный и синий), и изображение Спасителя таким образом, что его силуэт выделяется на фоне окна. Фигура Иуды (четвёртый справа от Христа) смещена со своего обычного места
Поскольку расположение тринадцати человек по одну сторону стола несколько неестественно, их прямое сопоставление поднимает эмоциональный накал, а уходящая вглубь перспектива (комната изображена в виде трапеции) создаёт эффект «выталкивания» фигур к зрителю. Возможно, черпая вдохновение у своего друга Луки Пачоли (ок. 1445–1517), для книги которого «О божественной пропорции» (1509) Леонардо сделал несколько иллюстраций, он выстроил композицию фрески по системе пропорций, аналогичной соотношениям музыкальных интервалов.
Деятельность Леонардо в первое десятилетие XVI века была столь же разнообразна, как и в другие периоды его жизни. Несмотря на увлечение математикой, он продолжал заниматься живописью. В это время было создано полотно «Мадонна с Младенцем и святой Анной», и около 1504 года Леонардо начал работу над своей знаменитой картиной «Мона Лиза», портретом жены флорентийского купца. Этот портрет (он находится в Лувре) является дальнейшей разработкой типа, появившегося у Леонардо ранее: модель изображена по пояс, в лёгком повороте, лицо обращено к зрителю, сложенные руки ограничивают композицию снизу. Одухотворённые руки Моны Лизы так же прекрасны, как лёгкая улыбка на её лице и первобытный скалистый пейзаж в туманной дали.