14 августа 1865 г. в Гаштейне Австрия и Пруссия подписали конвенцию с целью урегулирования вопроса о герцогствах Шлезвиг и Гольштейн, по которой право собственности на всю территорию обоих герцогств принадлежало Австрии и Пруссии, но управление ими объявлялось раздельным. В Гольштейне создавалась австрийская администрация, а в Шлезвиге — прусская.
Разрешив шлезвиг-гольштейнскую проблему, Бисмарк пошел на следующий шаг по пути объединения Германии «железом и кровью» — вытеснение Австрии из Германии. Новый экспансионистский шаг был подготовлен дипломатически. Бисмарку удалось заручиться нейтралитетом Наполеона III, пообещав не препятствовать присоединению к Франции части Бельгии и даже левого берега Рейна. В апреле 1866 г. Бисмарк заключил тайное соглашение с Италией, пообещав ей не мешать присоединению Венеции. После этого прусский канцлер прямо перешел в наступление. Он предложил Вене обсудить вопросы реформирования Германского союза, созданного решениями Венского конгресса, и пересмотреть статус Гольштейна, куда в июне 1866 г. были введены прусские войска. Постановка этих провокационных для Австрии вопросов вызвало войну. Бундестаг Германского союза по предложению Австрии решил начать мобилизацию. В ответ на это 16 июня прусские войска вступили в Саксонию, Ганновер, Гессен-Кассель и перешли австрийскую границу. На стороне Австрии выступили Бавария и некоторые другие южногерманские государства, но их военные силы были незначительны. Положение Австрии резко ухудшилось из-за того, что с юга на нее напала Италия, что заставило австрийцев вести войну на два фронта. В военных действиях против итальянских войск австрийцам сопутствовала удача, они разбили итальянцев в сражении под Кустоццей. Успешными были действия австрийского военно-морского флота на Адриатике. Однако на основном театре военных действий австрийские войска были вынуждены отступать. Неожиданно для всей Европы кампания здесь была решена почти за месяц. 3 июля 1866 г. под деревней Садова (в Чехии) пруссаки нанесли австрийской армии решающее поражение. Прусская армия вторглась на территорию собственно Австрии, неудача постигла и войска союзников. Был открыт путь на Вену. Однако трезвомыслящий Бисмарк, опасаясь, что продолжение войны приведет к вмешательству Франции, а это может сорвать планы объединения Германии под эгидой Пруссии, настоял на немедленном заключении мира.
26 июля между Австрией и Пруссией был подписан Никольсбургский прелиминарный мирный договор, территория Австрийской империи, за исключением Венеции, которая передавалась Италии, оставалась нетронутой. Более того, Пруссия обязалась после заключения окончательного мира вывести войска из австрийских владений. Австрия признала «новую организацию Германии без участия Австрийской империи» и согласилась на создание союза германских государств к северу от р. Майн. Территория Саксонского королевства оставалась неизменной, а его будущее положение в Северогерманском союзе подлежало определению в отдельном мирном договоре.
Окончательно результаты войны между Пруссией и Австрией были закреплены мирным договором от 23 августа 1866 г. Австрия передавала Пруссии все права на Шлезвиг и Гольштейн при условии, что Северный Шлезвиг будет воссоединен с Данией, если его население на референдуме пожелает этого. Со своей стороны Пруссия обязалась вывести войска с территории Австрии не позднее чем через три месяца после ратификации договора. Возобновлялось действие всех договоров, заключенных между Австрией и Пруссией до войны, Германский союз упразднялся. Австрия оказалась фактически вытесненной из Германии, объединение которой теперь окончательно пошло по «малогерманской» модели.
Военное поражение поставило Габсбургов перед серьезной проблемой, тем более что отношения с подвластной Венгрией обострились. Уже через день после подписания Пражского мира, 25 августа 1866 г. начались переговоры Вены с венгерской оппозицией, в результате которых страна была преобразована в своеобразное конфедеративное государство на дуалистических началах, с двумя центрами, которое стало называться Австро-Венгрия.
Благодаря поражению Австрии ускорился процесс завершения объединения Италии. 3 октября 1866 г. в Вене был подписан мирный договор между Австрией и Италией, который подтвердил передачу Венецианской области Италии и установил новую границу. Процесс объединения Германии вокруг Пруссии пошел полным ходом. Вскоре к ней были присоединены Ганновер, Гессен-Кассель, Нассау, Франкфурт-на-Майне, причем Бисмарку потребовалось немалое дипломатическое искусство, чтобы побудить Александра II отказаться от вмешательства под предлогом защиты «легитимных» прав германских монархов. В начале 1867 г. был образован Северогерманский союз, в котором под главенством Пруссии объединились все германские земли к северу от р. Майн. Германские государства к югу от Майна были вынуждены заключить с Северо-Германским союзом оборонительные и наступательные договоры. Теперь на пути завершения объединения оставалась лишь Франция.