В датском правительстве излишне оптимистично рассчитывали на поддержку в конфликте с Германией со стороны Наполеона III и на благожелательную позицию Великобритании. Однако политическое положение в Европе в это время изменялось не в пользу Дании. Поэтому, когда в ноябре 1863 г. датский парламент принял общую для Дании и Шлезвига конституцию, оппоненты этого решения в самой Дании говорили о нарушении юридических основ датской монархии, которые нейтральные державы считали необходимым соблюдать для поддержания европейского равновесия. Разрыв соглашений 1851–1852 гг. мог привести к войне, завоеванию Гольштейна и оккупации Пруссией датских портов. Согласно новой конституции вводился двухпалатный парламент — ригсрод, в котором за депутатами от Дании обеспечивалось большинство. Конституция должна была вступить в силу с 1864 г. после подписания ее королем. Этот документ был явным вызовом германским государствам.
Вступивший на датский престол Кристиан IX Глюксбург, несмотря на просьбы Франции и России отложить подписание новой конституции Дании и Шлезвига, 18 ноября под давлением своего правительства и общественного мнения все же подписал новый текст основного закона. В ответ Бисмарк заявил, что эта конституция является нарушением соглашений 1851–1852 гг., но, предпочитая прямо присоединить герцогства к Пруссии, он нуждался в поддержке своих планов со стороны других ведущих держав. С целью получить такую поддержку Пруссия одобрила предложение Наполеона III от 5 ноября 1863 г. о созыве конгресса для урегулирования судьбы Польши и замены Венской системы новыми соглашениями. С той же целью Бисмарк поддержал и Россию в ходе польского восстания 1863–1864 гг.
Пруссия и Австрия выставили условием признания Кристиана IX отмену ноябрьской конституции, франкфуртское Союзное собрание 7 декабря 1863 г. постановило оккупировать Гольштейн. Франция, Англия и Россия также поддержали требование отмены новой конституции через совместный демарш своих чрезвычайных посланников в Копенгагене.
Во время правительственного кризиса в Дании произошла оккупация Гольштейна немецкими войсками, а 30 декабря герцог Августенбургский вступил в Киль. Эти события заставили Великобританию 31 декабря 1863 г. предложить собрать мирную конференцию. Бисмарк, зная об изоляции Англии и о том, что ее не поддерживают Франция и Россия, предварительно потребовал отмены конституции. 16 января 1864 г. Пруссия и Австрия направили датскому правительству ультиматум, который был им отклонен, а 1 февраля 1864 г. австрийские и прусские войска в 60 тыс. человек заняли Шлезвиг. Началась новая война между Данией и германскими государствами, к которой сама Дания была слабо подготовлена. В Копенгагене возлагали большие надежды на укрепленную линию Даневирке, но ее оборона силами малочисленного датского войска в зимних условиях оказалась невыполнимой задачей. К марту 1864 г. сорокатысячная датская армия отступила через Фленсбург на укрепленные позиции у г. Дюбель, тогда как другая часть датской армии отошла на север Ютландии в крепость Фредерисия. 18 апреля 1864 г. прусско-австрийские войска разгромили датчан у Дюбеля, где последние продержались около 10 недель, понеся значительные потери. 29 апреля датские войска вынуждены были оставить Фредерисию и эвакуироваться на острова Альс и Фюн.
Перспективы военной помощи Дании со стороны Англии и Франции были минимальными. В этих условиях России удалось добиться созыва в Лондоне весной 1864 г. конференции для разрешения конфликта. 25 апреля 1864 г. в Лондоне при участии Великобритании, Франции и России начались мирные переговоры между представительствами воюющих государств. После ряда военных успехов цель Пруссии была сформулирована открыто — присоединение герцогств. Бисмарку удалось заставить конференцию принять решение разделить Шлезвиг. Датское правительство отказалось рассматривать всякую границу, исключающую с ее территории г. Фленсбург и смешанную территорию, настаивая на линии Шлей-Даневирке. Посредничество Англии и Франции ни к чему не привело, идея плебисцита в смешанных районах после отвода австро-прусских войск также не была принята датчанами. Неудачный исход лондонской конференции означал для Дании потерю Шлезвига. Конференция также выявила и гибельный для Дании антагонизм между Англией и Францией, ставший прологом к неизбежной гегемонии Германии.
25 июня военные действия между Данией и германскими государствами возобновились. Немцам удалось взять о. Альс, австрийский флот подошел к датским водам, Ютландия уже была занята вплоть до Скагена. Расчет на помощь Великобритании или Франции оказался нереалистичным. В этих условиях новое датское правительство немедленно начало переговоры с Пруссией и Австрией, которые привели к Венскому договору 30 октября 1864 г. Король Дании оставлял прусскому королю и австрийскому императору Гольштейн, Лауэнбург и Шлезвиг.