Расторопному Спаде было дано приказание во что бы то ни стало разыскать заблудшую овечку. Через пару дней парню удалось не только найти, но чуть не силком привести её к Караваджо. Едва увидев его с побитой физиономией, Лена расхохоталась, но узнав, что именно она явилась причиной драки, принялась поправлять повязку своему незадачливому ухажёру.
— Работа предстоит очень ответственная, — пояснял Караваджо, уговаривая её позировать, — поэтому будь умницей и слушайся меня во всём. В соборе Святого Петра перед вашим с сыном портретом люди будут запалять свечи и возносить хвалу. Вот когда тебе отпустятся все прежние и нынешние грехи!
Последнее он произнёс со смехом, но, вероятно, именно эти его слова подействовали на девицу, и она согласилась позировать. В сравнении с жалкой мастерской в Сан-Бьяджо с её обшарпанными стенами и затоптанным полом богатое убранство особняка произвело на неё сильное впечатление. На следующий день она привезла из приюта подросшего сына Стефано, и Караваджо приступил к написанию большого полотна «Мадонна Палафреньери» или «Мадонна со змеёй» (292x211). Это последняя написанная им в Риме работа.
Луч света слева скользит по трём фигурам, выхваченным из тьмы заднего плана. Кроме лёгких нимбов над головами Девы Марии и её матери Анны картина лишена признаков святости и представляет собой чуть ли не жанровую сцену. Ребёнок хочет вырваться из рук матери при виде ползущей по полу змеи, этого символа первородного греха. Обеспокоенная за сына Дева Мария старается остановить ползущую тварь, наступив ей босой ногой на горло и заставив злобно шипеть и извиваться. По поводу этого факта между теологами в 1569 году разгорелась целая дискуссия, пока папа Пий V не установил, что ползущего гада должны убивать оба — мать и сын. Вот почему на картине Караваджо ребёнок, словно забавы ради, прижимает ножку к ноге матери. Эти тонкости художник мог почерпнуть из книги Чезаре Рипы «Иконология», изданной в 1593 году и ставшей верным путеводителем по миру религиозной символики для нескольких поколений живописцев. В последнюю очередь была написана святая Анна, для которой позировала привезённая Леной вместе с сыном из приюта старая сестра милосердия с выразительными чертами лица, словно очерченными резцом скульптора. Как изваяние, она стоит особняком, скрестив натруженные руки на животе, и безучастно наблюдает за борьбой или игрой дочери и внука со змеем-искусителем.
В дни работы над картиной выздоравливающего художника навещали друзья. Они с интересом наблюдали, как Караваджо живописует светом и тенью, как накладывает мазки один на другой. Но особенно их привлекала красавица Лена, которая порой капризничала и вступала в пререкания с художником. Всё это забавляло друзей — особенно то, что Караваджо непривычно спокойно сносил колкости капризной натурщицы, не вступая с ней в перепалку, лишь бы она оставалась в заданной позе. В этой работе ему удалось добиться подлинных вершин реалистической трактовки сугубо религиозного сюжета и жизненной достоверности образов. Картина обрела почти жанровый характер, напоминая первые работы художника из жизни римского простонародья.
Когда работа была закончена, поэт Милези посвятил ей хвалебную оду, а друг хозяина дома, эрудит и археолог Кастеллини, в поэтическом посвящении, помимо восторженных слов в адрес мастера, сравнил фигуру Анны с греческой скульптурой. В чём-то он был прав — статичная поза Анны в тяжёлых одеяниях с выразительными складками написана почти монохромно в коричневато-серых тонах жёсткими мазками, предвосхищая манеру позднего Караваджо.
В отличие от Анны, словно вышедшей из греческой трагедии, Мария преисполнена материнской любви. В её лёгкой фигуре отразились сама женственность и несказанное изящество. Словно предчувствуя, что это последняя его работа с Леной, Караваджо вложил в неё ту любовь, что ощущается и в изгибе шеи, и в наклоне милой головки. Выразительна фигурка подросшего ребёнка Христа, на лице которого смешаны чувства любопытства и испуга перед извивающимся на полу шипящим гадом.