Подготовка к ее изданию началась еще до приезда Ивана Федорова в Острог. Из наиболее видных представителей литературно-научного кружка при Острожской академии был создан своеобразный редакционный совет. В него входили Тимофей Аннич, Герасим Смотрицкий и др. Иван Федоров, приехав в Острог, принял активное участие в работе совета. Параллельно с печатанием «Азбуки», Нового Завета с Псалтырью, «Книжки собрание вещей нужнейших» он занимался и подготовкой издания Библии.
Прежде всего нужно было найти полный и исправный оригинал, с которого можно было бы печатать. В предисловии к Библии сказано, что оригиналы для нее искали «во всех странах роду нашего, языка словенского». Согласно некоторым сведениям, Иван Федоров ездил в Болгарию и Сербию для поисков южнославянских списков Библии. В октябре 1579 года Иван из Сочавы — серб, живший во Львове и служивший у К. Корнякта, подал заявление львовским городским властям о том, что он отказывается от претензий, которые возникли у него к Ивану Федорову «в Валахии и турецких землях». (Турецкими землями тогда называли южнославянские страны, захваченные турками.) Из этого заявления следует, что Иван из Сочавы и первопечатник совершили совместное путешествие, во время которого между ними возник какой-то конфликт.
Еще одним, хотя и косвенным подтверждением того, что Иван Федоров побывал в южнославянских странах, является экземпляр Острожской Библии, доныне хранящийся в сербском монастыре Раваница на Фрушской горе. На этом экземпляре есть вкладная надпись, выполненная киноварью, в которой говорится, что 1 декабря 1583 года некий «слуга» князя Острожского «предах сию Библию… обители пречестного Вознесения Господня монастыря, прозываемого Раванице в земле сербской». Хотя даритель не называет себя по имени, E. Л. Немировский, обнаруживший этот экземпляр, предположил, что им был Иван Федоров. Княжескими слугами или служебниками официально назывались многие сотрудники князя Константина Острожского, в том числе и Иван Федоров. Кроме того, на Ивана Федорова указывает и то, что надпись сделана киноварью, которую любили в Москве, а в южнославянских землях использовали крайне редко. Вряд ли первопечатнику пришло бы в голову посылать книгу в далекий монастырь, если бы он сам там не побывал и не завел знакомых среди братии.
Различные списки Библии были доставлены в Острог также из Рима, из чешских земель, но наиболее полный экземпляр — Геннадиевская Библия — был привезен Михаилом Гарабурдой из Москвы.
Острожский научно-литературный кружок проделал огромную текстологическую работу по подготовке издания Библии. Тексты, переведенные с латыни, были сверены с греческими, часть их переведена заново.
Для печатания Острожской Библии первопечатник отлил новые шрифты, вырезал новые гравировальные доски.
Поначалу редакционный совет намеревался украсить Библию сюжетными гравюрами на металле. Эта сложная, трудоемкая и очень дорогая техника в те времена еще редко использовалась в Западной Европе, а в Восточной была практически неизвестна. Первопечатник начал переговоры с немецким мастером — гравером из города Вроцлава Блазиусом Эбишем. Между ними было заключено соглашение, по которому Эбиш обещал «Ивану Хведоровичу, проживающему в Остроге русскому типографу ясновельможного воеводы Киевского Константина», «вырезать на медных пластинах как можно лучше, насколько сумеет, изображения к истории святой Библии соответственно последовательности эпизодов и глав в количестве ста пятидесяти». За работу он запросил 700 золотых, а кроме того, наниматель обязывался все время, что мастер будет работать, обеспечивать его самого, его семью и подмастерьев питанием.
Предполагалось, что Эбиш приедет во Львов ко дню святой Агнешки — 21 января 1579 года, — когда в городе устраивалась традиционная ежегодная ярмарка. Однако этот приезд был отменен, и Острожская Библия вышла без гравюр немецкого мастера. Почему издатели Библии отказались от первоначального замысла — неизвестно. Высказывались предположения, что плата, запрошенная Эбишем, показалась им слишком высокой. Однако издание финансировал князь Острожский, а для него уплатить 700 золотых не представляло никаких затруднений. Более вероятно, что у издателей вызвала сомнение сама идея оформить Библию сюжетными гравюрами. Возможно, они решили, что такое нетрадиционное для русских книг оформление, к тому же выполненное мастером-немцем, сделает Библию похожей на лютеранскую, и решили не рисковать. Острожская Библия была оформлена традиционными орнаментальными гравюрами-заставками на дереве работы самого Ивана Федорова.
В период подготовки Библии в жизни Ивана Федорова произошла непонятная и неприятная история.