Накануне Великой Отечественной войны в штат воздушно-десантного корпуса входил танковый полк, на вооружении которого должны были состоять 50 единиц Т-38.
Боевое крещение советские танки-амфибии получили в ходе вооруженных конфликтов на Дальнем Востоке. Правда, использовались они в весьма ограниченном количестве. Так, в частях и соединениях Красной Армии, участвовавших в боевых действиях в районе реки Халхин-Гол, танки Т-37А имелись только в составе стрелково-пулеметного батальона 11-й танковой бригады (8 единиц) и танкового батальона 82-й стрелковой дивизии (14 единиц). Судя по отчетам, они оказались малопригодными и в наступлении, и в обороне. В ходе боев с мая по август 1939 года 17 из них были потеряны.
В составе стрелковых и кавалерийских частей Красной Армии (к тому времени в танковых бригадах западных военных округов танков-амфибий уже не было) Т-37А и Т-38 приняли участие в «освободительном походе» в Западную Украину и Белоруссию, в сентябре 1939 года. Боевых действий в ходе этой операции практически не велось. Имели место лишь отдельные стычки с польскими войсками. Так, например, плавающие танки участвовали в столкновении с польскими частями в районе города Холм 20–22 сентября. При этом были потеряны три Т-37А из состава танковых батальонов 45-й и 367-й стрелковых дивизий. В «Отчете о действиях танковых войск Красной Армии в Польше» о плавающих танках говорилось следующее: «Танки Т-38 как машины разведки не соответствуют поставленным им задачам. В ходе всей операции они не успевали за танками Т-26…
Танки Т-37А в ходе маршей часто выходили из строя, проходимость низкая, отставали даже от пехотных подразделений».
К началу боевых действий с Финляндией 30 ноября 1939 года в частях Ленинградского военного округа насчитывалось 435 Т-37А и Т-38, которые довольно активно участвовали в боях. Так, например, 11 декабря на Карельский перешеек прибыл 18-й отдельный танковый батальон в составе 54 танков Т-38. Батальон был придан 136-й стрелковой дивизии, его танки использовались в качестве подвижных огневых точек на флангах и в промежутках между боевыми порядками атакующих пехотных подразделений. Кроме того, на танки Т-38 была возложена охрана командного пункта дивизии, а также вывоз с поля боя раненых и доставка боеприпасов.
В составе 70-й стрелковой дивизии действовал 361-й танковый батальон (10 Т-26 и 20 Т-38). 2 декабря взвод Т-38 был послан в разведку к станции Ино. В ходе выполнения задачи наши танкисты встретили до батальона финской пехоты с артиллерией, пытавшейся зайти в тыл советским частям. Танки приняли ночной бой, длившийся до утра, и сорвали атаку противника. Артиллерийским огнем финнов было подбито три танка Т-38.
К началу войны с Финляндией танковые войска 9-й армии состояли из 177-го отдельного разведывательного батальона 122-й стрелковой дивизии и отдельного разведывательного батальона 163-й стрелковой дивизии. В двух этих частях насчитывалось 29 танков Т-37А и два Т-38. Вначале они использовались главным образом для разведки, а затем были распределены между стрелковыми полками.
За 15 дней боев почти все танки вышли из строя, подорвавшись на минах. Воевали Т-37А и Т-38 и на Мурманском направлении. Причем на второстепенных участках фронта для поддержки пехоты, помимо этих танков, применялись и танкетки Т-27, и даже полубронированные тягачи «Комсомолец».