Вновь собор был отстроен по заказу царя Федора Иоанновича и его жены царицы Ирины Годуновой в 1587–1588 годах; как говорит летописец, он был сделан «больши старого». Юго-западный угол старого храма, где располагались наиболее чтимые захоронения, по мнению специалистов, при перестройке не потревожили и включили в новый храм. На плане Кремля 1600-х годов мы видим стройное здание с мощным пятиглавием и большими полукруглыми закомарами. Круглое окно в центральной закомаре схоже с таким же окном Архангельского собора. Вознесенский собор имел три апсиды, четыре внутренних столпа; стены его по-ренессансному членились на три яруса карнизами и на три прясла двухъярусными пилястрами. В качестве образца для нового храма вновь послужил Архангельский собор Кремля: прообразом для церкви-усыпальницы великих княгинь и цариц стал храм-усыпальница их мужей. Возможно, Борис Годунов, пока еще царский шурин, вдохновитель замысла нового собора, желая упрочить свое положение неофициального правителя страны, хотел, чтобы его родство с царицей было зримо и монументально воплощено в Кремле; отсюда и прототип в виде «царского собора».
В Вознесенском соборе не были повторены резные детали и классический ордер собора-прототипа, но схема членения фасадов была точно воспроизведена. Очень изящная обработка стен собора как бы маскировала их двухметровую толщину. Покрыт собор первоначально был по закомарам; четырехскатная крыша, видная на старых фотографиях, явно поздняя. По размерам плана Вознесенский собор уступал в Кремле Успенскому и Архангельскому соборам, но превосходил чудовский и Благовещенский.
Собор конца XVI века был первым и одним из ярких памятников так называемой «годуновской школы», которые очень высоко ценятся историками русской архитектуры. Композиция этих храмов отличается особой стройностью, боковые главы смещены к центральной, поставленной на постамент. На фасадах используется ордерная система, причем художественные качества «годуновских» соборов заставляют исследователей говорить о чрезвычайно высоком профессиональном уровне мастеров. Будучи объектами «царского заказа», эти храмы, в том числе и Вознесенский, становились примерами для подражания и определяли в конечном счете стиль эпохи. Размеры Вознесенского собора повторены в Троицком соборе Антониева-Сийского монастыря на Русском Севере (1588): «а церковь де мерою заведена в Вознесенскую меру, что в Девиче монастыре у нас на Москве»; близки к Вознесенским и параметры Рождественского собора (конец 1580-х гг.) Пафнутьева-Боровского монастыря. По образцу Вознесенского собора выстроены Вознесенский собор Печерского монастыря в Нижнем Новгороде (1631–1632), Софийский собор в Тобольске (1683–1686): «Мы, Великий государе указали в Тобольску соборную церковь Софии… построить каменнуе против образца какова в Москве в Кремле в девичьем Вознесенском монастыре… а какова Вознесенская церковь мерою кругом и в вышину и тому посланы… к вам образцы и сметные росписи и чертежи», — гласит царская грамота. «Итальянизированные» черты фасадных декораций, восходящие к Вознесенскому собору, исследователи обнаруживают в нескольких знаменитых храмах XVI–XVII вв.
В конце XVII века собор был вновь возобновлен, после чего его освятили 14 ноября 1696 года. Известно, что тогда в нем были пробиты новые окна. Перестраивался он и в XVIII столетии, особенно после пожара 1737 года. Иконостас был устроен в 1721 году, при возобновлении собора по приказу Петра I. Царские врата и пять икон местного чина иконостаса были «греческого письма». Интересны в нем иконы с изображениями страстей Христовых, скопированных с иллюстраций к голландской Библии Пискатора. Драгоценный киот с частицами святых мощей, устроенный царицей Ириной Годуновой, украшал храмовую икону Вознесения. Некогда на стенах собора были изображения похороненных здесь государынь, но их сменила поздняя роспись 1812-го и 1870 годов. Перестраивался храм и в 1823 году, реставрировался в 1870–1880-е годы.
Собор славился богатой ризницей и резным барочным распятием с предстоящими. За престолом примечателен был большой крест с 14 отверстиями, в которых помещены были части св. мощей. Крест устроен был в 1816 году в память избавления от французов.
Мощи княгини Евдокии почивали в храме в посеребренной раке. У гроба основательницы в XVII веке неотлучно находились пять вознесенских стариц.
Вознесенский собор имел два придела: Успенский, освященный в 1731 году, — его устроил и в нем был похоронен московский генерал-губернатор В. Ф. Салтыков, брат царицы Прасковьи Федоровны, — и Всех Скорбящих (1732), устроенный императрицей Анной Иоанновной в память о своей сестре, царевне Параскеве.
В XVIII–XIX столетиях главный монастырский храм оказался зрительно оттесненным на второй план новыми монастырскими постройками. На предреволюционных фотографиях, как правило, видно лишь его мощное завершение с древними шлемовидными очертаниями глав.