Приток экспонатов увеличивался с каждым годом: из Выборга прислали овцу, у которой по сторонам по два глаза и два языка; из Тобольска было получено несколько барашков: у одного из них восемь ног, у другого три глаза, два туловища и шесть ног. В Нижнем Новгороде родился младенец с тремя ногами, а в Уфе — с двумя головами. Они тоже оказались экспонатами Кунсткамеры. Царь сам поставлял экспонаты в музей: из Дербента он распорядился доставить деревянное блюдо с серебряным ключом, преподнесенным русским войскам правителем завоеванного города, а также медное ядро, которым стреляли из крепости.
В Кунсткамере хранились также пушки старинного литья. Русскому послу в Голландии Борису Ивановичу Куракину царь дважды предписывал покупать в европейских странах старинные пушки русского производства, захваченные шведами в предшествующих войнах. Теперь Швеция решила продажей их пополнить оскудевшую казну. Удивляла щедрость Петра, обычно прижимистого, но в данном случае рекомендовавшего не скупиться при покупке музейных экспонатов. Куракину он писал: «Старайтесь их купить, а наипаче такие, которые гораздо стары, чтоб их не упустить в другие руки, и для того не жалейте денег».
Петр воспользовался еще одним источником пополнения Кунсткамеры. Уже в XVII веке правительство снаряжало специальные экспедиции для поисков полезных ископаемых, главным образом благородных металлов, а также для описания вновь присоединенных к России земель. Петр расширил задачи подобных экспедиций. Важнейшая из них, под началом доктора Мессершмидта, была отправлена в 1720 году сроком на семь лет для обследования Сибири. Мессершмидту поручалось изучить географию страны, описать народы, ее населявшие, заняться изучением языков аборигенов и сбором памятников древностей.
Мессершмидт прислал для Кунсткамеры большое количество чучел птиц и животных Сибири, а также древние памятники живших там народов, коллекции по этнографии. В итоге собрание Кунсткамеры по богатству и разнообразию экспонатов уже к концу жизни Петра приобрело славу едва ли не самого богатого в Европе.
В одной из комнат помещалось несколько тысяч анатомических препаратов по эмбриологии и анатомии человека, а также всевозможных мелких животных. В другой комнате были расставлены склянки с человеческими плодами от зародыша до зрелости, с различными монстрами, а также чучелами рыб.
Остальные комнаты предназначались для размещения чучел животных и птиц, а также этнографических и нумизматических экспонатов. Демонстрируемым предметам стремились придать выразительность путем их сочетания, иногда нелепого, но внешне эффектного. Сложными и замысловатыми композициями отличалась коллекция Рюйша: змея держит в зубах семинедельный человеческий плод; шестимесячный плод в гробу украшен венком из цветов, запах которых он будто бы вдыхает. Анатом проявлял также изобретательность при размещении внутренностей человека и показе больных органов.
На втором этаже Кикиных палат стояли шкафы, забитые книгами. Библиотека комплектовалась из разных источников при самом активном участии Петра. В основе ее лежала библиотека Аптекарской канцелярии, перевезенная из Москвы в Петербург в 1712 году и состоявшая преимущественно из медицинских книг. Позже библиотека пополнилась книжным собранием герцога Голштинского, подаренным Петру вместе с Готторпским глобусом. В состав библиотеки влилось также книжное собрание герцога Курляндского. Наконец, библиотека пополнялась за счет книг, конфискованных у опальных вельмож, а также вымороченных библиотек. В их числе библиотека царевича Алексея, барона Шафирова, умершего царского лекаря Арескина и др. Австрийский резидент Вебер записал еще в 1716 году о Кунсткамере: «По справедливости заставляет удивляться, каким образом такое громадное, драгоценное собрание могло быть составлено в столь короткое время»; о библиотеке: «Если будет продолжаться постоянное приращение и теперь уже драгоценной библиотеки, то в немного лет она станет наряду с важнейшими европейскими не по числу, но по достоинству находящихся в ней книг». К 1725 году библиотека представляла огромное по масштабам тех времен книжное собрание. Ее фонд насчитывал около 11 тысяч томов. Это дало основание современнику отозваться о ней так: библиотека в Петербурге не уступала «никакой другой подбором и богатством превосходнейших книг».
Кунсткамера и библиотека были в 1719 году открыты для свободного обозрения и пользования. Обоим учреждениям царь с самого их возникновения придавал просветительский характер. «Я хочу, — говорил он, — чтобы люди смотрели и учились». Когда Павел Иванович Ягужинский предложил Петру установить плату за посещение Кунсткамеры и пользование библиотекой, как это делалось в странах Западной Европы, тот отклонил это предложение, заявив: «Я еще приказываю не только всякого пускать сюда даром, но если кто приедет с компаниею смотреть редкости, то и угощать их на мой счет чашкою кофе, рюмкою водки, либо чем-нибудь иным в самых этих комнатах». На угощение была отпущена значительная по тем временам сумма — 400 рублей в год.