В начале 1480-х гг. Моро задумал увековечить память своего отца Франческо Сфорца, установив в Милане его бронзовую конную статую. Леонардо решил создать «коня», равного которому еще не было. От изображения животного, поднявшегося на дыбы, он отказался не столько по техническим, сколько по этическим соображениям: такое положение коня наверняка затмило бы героического всадника. Леонардо досконально изучил анатомию лошади, сделал множество подготовительных рисунков, уделяя особое внимание проблеме равновесия, и в конце концов изготовил полномасштабную модель из глины (1493 г.), которая принесла своему создателю известность. Дальнейшая судьба «коня» печальна: так и не дождавшись отливки в бронзе, статуя была разрушена в 1499 г., когда город захватили французские войска.
Созданная по заказу Лодовико Моро для трапезной доминиканского монастыря Санта-Мария делле Грацие стенная роспись «Тайная вечеря» (1495–1497 гг.) ныне принадлежит к самым известным произведениям мировой живописи. Мастер долго вынашивал композиционную идею, провел ряд расчетов и измерений, выстраивая перспективу, мучительно искал натурщиков, решился на смелый эксперимент с красками. Желая добиться наибольшей цветовой выразительности, он применил для фрески масло в смеси с темперой, предварительно загрунтовав стену составом из смолы и мастики собственного изобретения. Увы, этим он положил начало одной из величайших трагедий в истории искусства. Еще при жизни Леонардо краски начали отслаиваться и осыпаться, а проступавшая из стены влага покрыла поверхность картины уродливыми белесыми пятнами. В XVII в. в стене трапезной пробили дверь, уничтожив тем самым часть композиции, а во время оккупации Милана армией генерала Бонапарта в 1796–1797 гг. здесь была устроена конюшня. Многочисленные неумелые реставрации лишь ухудшили положение, и только в 1946 г. удалось закрепить остатки оригинальной живописи и приостановить ее дальнейшее разрушение. Но даже в своем теперешнем состоянии «Тайная вечеря» производит неизгладимое впечатление, являясь примером блестящего изображения психологического конфликта. Художник сумел найти такие способы и приемы живописи, которые помогли ему отразить внутренний мир библейских героев. Говорят, что французский король Людовик XII был столь очарован «Тайной вечерей», что всерьез расспрашивал своих инженеров, нельзя ли картину вместе со стеной перевезти во Францию.
К миланским работам Леонардо относится и «Мадонна Литта», а также портреты придворных Лодовико Сфорца, известные как «Дама с горностаем», «Портрет музыканта», «Портрет девушки в профиль», «Дама с ферроньеркой». Когда в 1499 г. Милан был захвачен французской армией, художник уехал из города, взяв в попутчики одного из своих учеников Андреа Салаи и ближайшего на то время товарища, монаха-францисканца, великого математика Луку Пачоли. Так началась для Леонардо пора странствий. Посетив по дороге Мантую и Венецию, он весной 1500 г. вернулся во Флоренцию. Однако уже в 1502 г. да Винчи стал архитектором и генеральным инженером у Чезаре Борджиа, хитроумного политика, который при помощи своего отца, папы Александра VI, стремился добиться власти над всей Италией. Вместе с писателем и дипломатом Никколо Макиавелли, послом Флорентийской республики при Борджиа, Леонардо сопровождал завоевателя во время его военных кампаний: рисовал карты, проектировал оборонительные сооружения, делал наброски каналов. Но, видимо, кочевая армейская жизнь пришлась ему не по вкусу, так как вскоре художник покинул службу у Чезаре и весной 1503 г. вернулся во Флоренцию, где работал над росписью в зале Большого совета дворца Синьории («Битва при Ан-гиари»).
В 1506 г. Леонардо вновь приехал в Милан, где его принял на службу французский наместник Шарль д’Амбуаз, герцог Шомон, давний поклонник создателя «Тайной вечери», а год спустя сам Людовик XII даровал художнику титул «королевского живописца и инженера». Оправдывая полученное звание, мастер пишет несколько картин, среди которых «Святая Анна с Марией и младенцем Христом», «Леда с лебедем», «Иоанн Креститель» и другие. Часть из них была создана при значительной помощи воспитанников, что позволило Леонардо больше времени уделять своим научным изысканиям.