В 1883 г. Павлов блестяще защитил докторскую диссертацию о центробежных нервах сердца. Он установил, что существуют особые нервные волокна, влияющие на обмен веществ в сердце и регулирующие его работу. Этими исследованиями было положено начало учению о трофической нервной системе. В июне 1884 г. Иван Петрович был командирован в Лейпциг, где в течение двух лет работал совместно с известными физиологами К. Людвигом и Р. Гейденгайном. Заграничная поездка обогатила Павлова новыми идеями. Он установил личные контакты с видными деятелями зарубежной науки.
Возвратившись на родину с солидным научным багажом, Иван Петрович начал читать лекции по физиологии в Военно-медицинской академии (так к этому времени была переименована Военно-хирургическая академия), а также врачам клинического военного госпиталя и с энтузиазмом продолжил исследования в убогой лаборатории при клинике Боткина. Она помещалась в маленьком, совершенно не приспособленном для научной работы ветхом деревянном домике, изначально предназначавшемся не то для дворницкой, не то для бани. Недоставало необходимого оборудования, не хватало денег на покупку подопытных животных и на другие исследовательские нужды. Но все это не мешало Павлову развить здесь кипучую деятельность.
За годы работы в лаборатории в полной мере проявились колоссальная трудоспособность, неукротимая воля и неисчерпаемая энергия ученого. Он сумел заложить крепкий фундамент своих будущих исследований физиологии пищеварения: обнаружил нервы, регулирующие секреторную деятельность поджелудочной железы, и поставил свой ставший классическим опыт с мнимым кормлением собак. Павлов считал, что эксперименты на животных необходимы при разрешении многих сложных и неясных вопросов клинической медицины. В частности, он стремился выяснить свойства и механизм терапевтического действия новых или уже применяемых в медицине лекарственных препаратов растительного и иного происхождения.
О результатах своих исследований Павлов регулярно сообщал на страницах отечественных и зарубежных научных журналов, на заседании физиологической секции Общества естествоиспытателей Санкт-Петербурга и на съездах этого же общества. За выслугу лет в 1887 г. его произвели в надворные советники, а три года спустя назначили на должность профессора фармакологии в Томском, а вслед за этим и в Варшавском университетах и, наконец, в самой Военномедицинской академии. Это место ученый занимал в течение пяти лет, до перехода на кафедру физиологии, которой он бессменно руководил три десятка лет, успешно сочетая блестящую педагогическую деятельность с интересной, хотя и ограниченной по масштабам научно-исследовательской работой. Его лекции и доклады пользовались исключительным успехом. Иван Петрович завораживал аудиторию своей страстной речью, неожиданными жестами, пылающим взглядом. Американский ученый Дж. Б. Келлог, побывав на одном из докладов, сказал, что не доведись Павлову стать известным физиологом, из него вышел бы превосходный драматический актер. Но лучшим красноречием Павлов считал язык фактов.
В 1890 г. был открыт Императорский Институт экспериментальной медицины, созданный на базе Пастеровской станции при материальной поддержке известного мецената — принца А. Ольденбургского. Именно он пригласил Павлова для организации отдела физиологии, которым ученый затем бессменно руководил 46 лет. В основном здесь были выполнены классические работы Павлова по физиологии главных пищеварительных желез, принесшие ему мировую славу. Метод фистул, разработанный Павловым, был крупнейшим достижением и позволял исследовать работу желез при разных условиях и составе пищи. Операция не нарушала нормальных связей организма со средой и в то же время позволяла проводить длительные наблюдения.
Все свои исследования Павлов проводил на собаках. Подопытное животное выхаживалось после операции не менее тщательно, чем больной человек. Так, при изучении столь важного органа, как поджелудочная железа, и создании маленького желудка для чистоты эксперимента ученому в течение полугода понадобилось три десятка собак, ни одна из которых не погибла. Наглядным доказательством правоты идей ученого стал пес Дружок, прославившийся на весь мир. Это была настоящая научная победа Павлова, за которой последовала целая серия блестящих экспериментов. Ученый рассказал о своих опытах, наблюдениях и приемах работы в книге «Лекции о работе главных пищеварительных желез» (1897 г.). За этот труд Иван Петрович стал четвертым лауреатом Нобелевской премии за выдающиеся достижения в области изучения физиологии пищеварения (1904 г.). До него этой награды удостаивались исключительно врачи. Работа физиолога была оценена как «принесшая наибольшую пользу человечеству». Она обессмертила имя Павлова и прославила российскую науку.