За время работы в лаборатории (1876–1878 гг.) Павлов самостоятельно выполнил ряд ценных работ по физиологии кровообращения. В этих исследованиях впервые проявились зачатки его гениального научного метода изучения функций организма в их естественной динамике в ненаркотизированном целостном организме. В результате многочисленных опытов Павлов научился измерять давление крови у собак, не усыпляя их наркозом и не привязывая к опытному столу. Он разработал и осуществил свой оригинальный метод вживления хронической фистулы мочеточников в наружный покров живота. За работы, сделанные за время учебы, Павлов получил вторую золотую медаль, а окончив Академию в декабре 1879 г. — диплом лекаря с отличием. Летом же он на с трудом сэкономленные деньги по рекомендации Устимовича побывал в Бреславле, где познакомился с работами видного физиолога профессора Р. Гейденгайна. Исследования Павлова по физиологии кровообращения привлекли внимание физиологов и врачей. Молодой ученый становился известным в научных кругах.
В 1879 г. Павлов принял заведование физиологической лабораторией при клинике С. Боткина, куда знаменитый русский клиницист пригласил его еще в декабре 1878 г. Тогда формально Ивану Петровичу предложили занять должность лаборанта, на деле же он должен был стать руководителем лаборатории. Павлов охотно принял это предложение, потому что незадолго до этого было закрыто ветеринарное отделение Медико-хирургической академии и он лишился работы и возможности проводить опыты. Здесь молодой ученый работал до 1890 г., достиг выдающихся результатов в области изучения физиологии кровообращения и пищеварения, принимал участие в разработке некоторых актуальных вопросов фармакологии, совершенствовал свое незаурядное экспериментальное мастерство, а также приобрел навыки организатора и руководителя коллектива научных работников.
Двенадцатилетняя работа в трудных условиях практически нищей физиологической лаборатории была вдохновенной, напряженной, целеустремленной и исключительно плодотворной, хотя и сопровождалась острой материальной нуждой и лишениями в личной жизни. Павлов стал видной фигурой на поприще физиологии не только у себя на родине, но и за ее пределами.
Выстоять в это трудное время Ивану Петровичу помогла жена. С Серафимой Васильевной Карчевской, слушательницей Педагогических курсов, Павлов познакомился в конце 1870-хгг. Их объединяла не только любовь, но и общность духовных интересов, близость взглядов. Они были привлекательной парой. Серафима Васильевна признавалась, что ее притягивала «та скрытая духовная сила, которая всю жизнь поддерживала его в работе и обаянию которой невольно подчинялись все его сотрудники и приятели». Любовь на первых порах целиком поглотила и Ивана Петровича. По свидетельству брата Дмитрия, молодой ученый некоторое время был больше занят сочинением писем к любимой девушке, чем лабораторными делами.
В 1881 г. молодые люди поженились, несмотря на то что родители Павлова были против этого брака, так как намеревались женить своего первенца на дочери состоятельного петербургского чиновника. После женитьбы и проявилась полная беспомощность Ивана Петровича в житейских делах. Супруга взяла на себя всю тяжесть семейных забот и на протяжении многих лет безропотно переносила все неприятности и неудачи, которые в ту пору сопутствовали ему. Своей верной любовью она, бесспорно, немало способствовала поразительным успехам Павлова в науке. «Искал в товарищи жизни только хорошего человека, — писал Павлов, — и нашел его в моей жене, терпеливо переносившей невзгоды нашего допрофессорского житья, всегда охранявшей мое научное стремление и оказавшейся столь же преданной на всю жизнь нашей семье, как я лаборатории». Материальные лишения вынудили молодоженов некоторое время жить у брата Ивана Петровича — Дмитрия, который работал ассистентом у знаменитого русского химика Д. И. Менделеева и имел казенную квартиру, и у своего приятеля Н. Симановского. Было в семейной жизни Павловых и горе: в младенчестве умерли два первых сына.
Иван Петрович всецело был предан любимому делу. Нередко свои мизерные заработки он тратил на покупку подопытных животных и прочие нужды исследовательской работы в лаборатории. Особенно тяжелое материальное положение семья испытала в период, когда Павлов готовил диссертацию на степень доктора медицинских наук. Серафима Васильевна неоднократно умоляла его ускорить защиту, справедливо укоряя, что он все время занимается оказанием помощи своим ученикам по лаборатории и совсем забросил собственные научные дела. Но Павлов был неумолим; он стремился получить все более значительные и достоверные научные факты для своей докторской диссертации и не помышлял об ускорении ее защиты. Со временем материальные невзгоды остались в прошлом, особенно после присуждения ученому Варшавским университетом премии им. Адама Хойнацкого (1888 г.).