В 1591 г. совершилось событие, имевшее огромное влияние на судьбу Бориса: 15 мая в Угличе погиб царевич Димитрий, причём жители Углича перебили людей, заподозренных ими в убийстве царевича. Следствие, произведённое на месте особой комиссией, присланной из Москвы, выяснило, что царевич, страдавший падучей болезнью, был не убит, но, играя в тычку ножом, в припадке упал на нож и зарезался. Народная молва обвинила в убийстве Бориса. Насколько действительно Борис виноват в преждевременной смерти царевича, остаётся до сих пор тёмным. Обвинение же Бориса в убийстве основывается, главным образом, на соображении, что смерть Димитрия была в интересах Бориса: она не только спасала его от опалы в будущем, но и очищала дорогу к престолу, После углицкого происшествия клевета не раз чернила Бориса, обвиняя его в различных злодеяниях и нередко истолковывая лучшие действия его в дурную сторону. Вскоре после смерти Димитрия (в июне того же 1591 года) в Москве вспыхнул сильный пожар, истребивший весь Белый город. Борис старался оказать всевозможную помощь погорельцам, и вот пронёсся слух, что он нарочно велел зажечь Москву, чтобы милостями привлечь её жителей. Нашествие крымского хана Казы-Гирея под Москву летом 1591 г. приписывалось также Борису, который будто бы желал тем отвлечь внимание народа от смерти Димитрия. Не пощадили Бориса даже от обвинения в смерти царя Фёдора, беспотомственная кончина которого ставила Бориса, имевшего много врагов, в трагическое положение.